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mRNA差異顯示方法研究進展
mRNA差異顯示方法研究進展[關(guān)鍵詞] DD-PCR 骨科學 研究
健康網(wǎng)訊: 馬慶軍 100083 骨科
黨耕町 100083 骨科
宋國立 美國加州大學圣地亞哥分校骨科與生物工程系 哺乳動物細胞約有100?000個不同的基因，在一定時間、空間中僅有10％～15％的基因表達，這種表達受到嚴格調(diào)控［1］。運用mRNA 差異顯示（differential display,DD）方法［2］，可將不同細胞類型或同一細胞在不同環(huán)境下表達的基因進行比較，從分子生物學水平上提供信息，這對理解細胞的生命過程極有幫助。該技術(shù)一經(jīng)問世，立即得到廣泛應用，但同時也遇到許多問題，所以Debouck［3］曾對該方法提出質(zhì)疑�，F(xiàn)將DD的研究進展簡要綜述如下。 一、DD方法基本原理 DD的基本原理是將具有可比性的細胞在某一條件下可表達的mRNA 群體通過逆轉(zhuǎn)錄方法變成相應的cDNA 群體，以此為模板，利用一對特殊引物，即3anchor 引物和5arbitrary引物，在一定條件下進行PCR擴增，得到與mRNA相對應的“標簽”（tags），然后用變性聚丙烯酰胺測序膠分析其差別，將有差別的基因克隆化，進一步分析其結(jié)構(gòu)與功能。DD依賴三種技術(shù)：（1）mRNA逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)；（2）以特定引物進行的PCR技術(shù)；（3）DNA測序膠電泳技術(shù)。 二、DD方法的優(yōu)點及其應用 用某一方法來尋找mRNA表達的差異，至少要滿足下列要求：（1）在一定時間、空間里，每一個細胞約有15 000種mRNA表達，其中除少數(shù)屬高豐度表達外，大量的屬于低豐度表達，即要求使用的方法足以顯示低豐度mRNA；（2）重復性要好；（3）實驗過程中能夠步步驗證比較（side-by-side comparison）；（4）得到的產(chǎn)物能代表相應的mRNAs或cDNAs，并能由此找到相應的cDNA 序列；（5）省時，簡便易行。 既往對mRNA的比較研究中多用減數(shù)雜交方法［4］（subtraction hybridization），該方法靈敏，可顯示低豐度RNA，但是步驟復雜，需時較長，而且在得到最終結(jié)果前無法步步驗證對照比較，故不易重復，并且需要大量的RNA作起始研究材料。這一點對RNA來源不易者（如手術(shù)活檢標本）極不利［5，6］。 DD的優(yōu)點在于：（1）僅需0.2 μg總RNA作為起始材料；（2）可同時分析多組樣品；（3）敏感性高，可檢出低豐度mRNA；（4）實驗周期短，約8天即可完成［7］，便于重復；（5）最突出的優(yōu)點是實驗過程中可步步驗證比較�？珊唵蔚貙D的特點概括為“3SRV”，即“Simplicity，Sensitivity，Speed，Reproducibility，Versatility”。 DD方法因有上述優(yōu)點，被廣泛應用。例如：Musholt等［8］應用DD方法對手術(shù)切下的髓樣甲狀腺癌標本與局部轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)進行了比較，發(fā)現(xiàn)了兩個新的表達基因MDF-1和MDF-2，并認為這兩個基因在髓樣甲狀腺癌的進展與轉(zhuǎn)移中起了重要作用；Zuo等［9］研究潰瘍性結(jié)腸炎的粘膜細胞，以正常結(jié)腸粘膜細胞作對照，找到了25個表達基因，其中有些與甲狀旁腺瘤、T細胞受體-β、卵巢癌等表達的基因同源。 關(guān)于神經(jīng)再生問題，Livesey等［10］發(fā)現(xiàn)了Reg-2基因，并認為該基因是哺乳類動物運動神經(jīng)元再生的關(guān)鍵基因。 在骨科領(lǐng)域，也有許多用DD方法的研究，Ryoo等［11］找到了一個與成骨細胞表型發(fā)育有關(guān)的細胞增殖標志基因PROM-1（proliferating cell marker）。更令人鼓舞的是，Boden等［12］用一種新的骨形成蛋白LMP-1基因轉(zhuǎn)染骨髓細胞，再作局部基因治療，在動物實驗中成功地進行了脊柱融合，LMP-1基因就是用DD方法克隆出來的。 此外，DD還應用于心血管病［13］、糖尿病［14］、胚胎發(fā)育［15］、先天性疾病［16］以及藥理學［17］和眼科學［18］等。不僅用于動物和人類，還應用于植物分子生物學研究［19］。 三、存在的問題與對策 DD方法存在的問題概括起來有兩方面：一是假陽性多（約50％～70％），二是得到的有差異cDNA片段短（約為110～500 bp）。因為這兩個問題，使許多研究者踟躕不前，這也是Debouk［3］提出質(zhì)疑的原因之一。 產(chǎn)生假陽性的原因，在于以下4個環(huán)節(jié)：（1）提取總RNA時，有染色體DNA污染，此DNA作為模板在PCR過程中被擴增；（2）從聚丙烯酰胺膠上挑選有差異條帶時，實驗組與對照組間信號對比不夠顯著；（3）在克隆階段挑選陽性菌落時，未能排除基因克隆中的假陽性；（4）研究中多次使用PCR技術(shù)，很難避免實驗室環(huán)境中的交叉污染。 解決這一問題的對策是：（1）提取RNA操作嚴格，得到的RNA必須經(jīng)過脫氧核糖核酸酶I(DNaseI) 充分消化，去除染色體DNA污染。（2）從聚丙烯酰胺膠上切取有差異條帶時，首選實驗與對照間信號差異顯者，最好是互為有或無的關(guān)系；如果僅僅是強與弱的關(guān)系，放在次選位置上。（3）即使是差異顯著地顯現(xiàn)為一條帶，也不能肯定是由某一cDNA 的均一分子泳動而成，有可能是結(jié)構(gòu)不同而分子量相同的cDNA共泳動（Co-migrat）的結(jié)果。對此，可用mSSCP 方法區(qū)別開來［7］。也可在基因克隆挑選時，用Reverse Northern原理作菌落原位雜交進行篩選［20］。（4）關(guān)于交叉污染問題的克服應服從分子生物學一般原則。（5）有差異基因的最終確認是用Northern雜交，如果選取了十幾或幾十條差異條帶，用Northern雜交工作量太大，若用Reverse Northern雜交則比較簡便［20］。 DD擴增片段較短(≤500 bp)，且擴增片段多位于3UTR（3untranslated region）范圍內(nèi)，很少能擴增到ORF （open reading frame）范圍內(nèi)。這一缺點是由使用的特殊引物所決定的，因此DD得到的是mRNA的標簽（tags）；由此帶來另一個問題，即這一位于3UTR范圍的標簽與Gene Bank 數(shù)據(jù)庫比較時，多數(shù)情況是與EST（expression seguence tags）比較，常不能滿足研究者的要求。 解決這一問題的對策是：（1）應用Targeted DD方法，基本原理是將5端引物延長，增加擴增片段的特異性［21，22］；或者用Stone和Wharton［23］報道的“targeted RNA fingerprinting”方法。這樣有可能使擴增片段特異性高，減少假陽性率，同時可能在Gene Bank數(shù)據(jù)庫中得到更多結(jié)構(gòu)與功能方面的信息；（2）用得到的cDNA 片段作probe篩選相應cDNA 文庫，得到cDNA 全序列，以便于基因結(jié)構(gòu)與功能研究。 四、展望 了解細胞在某一條件下的基因表達，對闡明生命過程(如生長發(fā)育與分化、細胞凋亡與衰老等生理過程)以及炎癥、腫瘤、心腦血管疾病等病理過程極為重要。DD方法在應用中被不斷完善，同時也有更新的技術(shù)問世，如DNA microarrays［24］，把大量寡核苷酸片段排列在相似于一種大規(guī)模集成電路式的生物芯片上，一次可完成數(shù)量相當可觀的反應，提供的信息是目前所有基因表達研究技術(shù)不可比擬的。但是，該方法在反應信號檢測與數(shù)據(jù)處理等方面需要昂貴設(shè)備，比較起來，DD方法還是有其優(yōu)越性，如果實驗設(shè)計合理，技術(shù)應用得當，相信對分子生物學研究有幫助。 參考文獻 [1] Maniatis T,Goodbourn S,Fischer JA.Regulation of inducible and tissue-specific gene expression.Science,1987,236:1237. 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