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正常妊娠及妊高征孕婦胎盤組織中細(xì)胞凋亡及增殖基因表達(dá)的研究
正常妊娠及妊高征孕婦胎盤組織中細(xì)胞凋亡及增殖基因表達(dá)的研究 [論文摘要] 目的：探討正常妊娠及妊高征（ PIH）孕婦胎盤組織bcl－2、bax及 ki67基因的表達(dá)及其相互關(guān)系。方法：采用免疫組化方法測定正常早、中、晚期妊娠30例及輕、中、重度 PIH36例的胎盤組織 bcl－2、bax及ki67的表達(dá)。結(jié)果：（l）bcl－2表達(dá)主要定位在絨毛的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞（S－cells），而 bax在 S－cells和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞（C－ceIIs）均呈陽性，在絨毛間質(zhì)中baX也呈陽性表達(dá)，但強(qiáng)度低于滋養(yǎng)層細(xì)胞。ki67定位于C－ceIIs；（2）bcl－2在晚期妊娠組的陽性率低于早、中期妊娠組（P＜0．05）。ki67在正常早、中、晚期妊娠組，對照組與 PIH組，輕、中、重度 PIH組之間均有顯著性差異（ P＜ 0.01）；（3）bcl－2和 bax表達(dá)及與 ki67的表達(dá)無相關(guān)性（P＞ 0．05）。結(jié)論：bcl－ 2及 bax在高水平上達(dá)到平衡，在胎盤組織中并不起介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主導(dǎo)作用，而且二者的表達(dá)不影響細(xì)胞的增殖。 [關(guān)鍵詞] 胎盤 細(xì)胞凋亡 bcl-2 bax ki67[論文] 人類胎盤不僅在胎兒—胎盤—母體的關(guān)系上起中心軸的作用，而且功能上失調(diào)會導(dǎo)致母體和胎兒的病理性變化，隨著妊娠的進(jìn)展，絨毛和滋養(yǎng)層不斷成熟和分化，已發(fā)現(xiàn)許多物質(zhì)包括原癌基因產(chǎn)物，在胎盤有生理性的表達(dá)。胎兒的發(fā)展特征是細(xì)胞群增殖和誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞凋亡成熟起來的，因此，胎盤在妊娠期間也經(jīng)歷著相似的變化。我們通過測定胎盤組織中細(xì)胞凋亡調(diào)控基因bcl-2、bax及細(xì)胞增殖基因ki67，進(jìn)一步探討了妊娠高血壓綜合征（PIH）的病理性變化。1 資料與方法1.1 臨床資料 隨機(jī)選擇1998年11月至1999年4月白求恩醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院及長春市婦產(chǎn)醫(yī)院婦科門診及產(chǎn)科病房的孕產(chǎn)婦66例。（1）妊高征組36例，平均26.14±3.42歲,平均孕37.44±3.9周,輕度9例,中度10例,重度17例；(2)正常妊娠組30例，孕早期10例，平均25.25±3.80歲，平均孕9.03±1.11周；孕中期5例，平均26.55±3.93歲，平均孕24.05±3.63周；孕晚期（對照組）15例，平均27.76±3.38歲，平均孕39.82±1.32周。1.2 標(biāo)本采集及處理 孕早期是行人工流產(chǎn)術(shù)者，孕中期是來自無妊娠合并癥、并發(fā)癥，要求終止妊娠而行水囊引產(chǎn)者，孕晚期為單胎足月初產(chǎn)婦，無妊娠合并癥、并發(fā)癥、以自然分娩及擇期剖宮產(chǎn)手主結(jié)束分娩，其剖宮產(chǎn)指標(biāo)主要是頭盆不稱及社會因素。妊高征組孕婦是無慢性高血壓、慢性腎炎及其它心腎疾病的病史者。早孕絨毛組織不需進(jìn)一步處理，取出后用生理鹽水沖洗凈，即用10%福爾馬林液固定。中、晚期胎盤組織于分娩后立即在母體面（避開鈣化、機(jī)化灶）隨機(jī)取3個(gè)不同區(qū)域約2cm×2cm×2cm胎盤組織，生理鹽水沖洗干凈后立即放入10%福爾馬林固定液中。1.3 方法 用免疫組化SP法，抗bcl-2、抗bax、抗ki67單克隆抗體即用型及SP試劑盒均購自福州邁新生物工程公司。每次染色均設(shè)陽性和陰性對照。1.4 結(jié)果判定 由2名醫(yī)師獨(dú)立觀察切片中10個(gè)高倍視野。（1）陽性標(biāo)準(zhǔn)：SP法顯示bcl-2及bax定位于胞漿和胞膜內(nèi)，反應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色。根據(jù)顯色程度分為4級：（-）為無著色，（+）為淡黃色，（++）為棕黃色，（+++）為棕褐色;（2）SP法顯示ki67以細(xì)胞核呈清晰棕褐色為陽性，按陽性細(xì)胞占C-cells的比例分為：陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為（-）；10%-20%為（+）；20%-30%為（++）；＞30%為（+++）。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Fisher精確概率檢驗(yàn)法，兩組計(jì)數(shù)資料用等級相關(guān)分析。2 結(jié)果2. 1 正常妊娠期胎盤組織中bcl-2、bax及ki67的基因表達(dá)bcl-2表達(dá)主要定位在絨毛的S-cells，而bax在S-cells和C-cells均呈陽性，同時(shí)在絨毛間質(zhì)中bax也呈陽性表達(dá)，但強(qiáng)度低于滋養(yǎng)層細(xì)胞；ki67蛋白主要定位在C-cells。bcl-2在晚期妊娠組的陽性率明顯低于早、中期妊娠組（P＞0.05）；ki67在晚期妊娠組的陽性率明顯低于早、中期妊娠組（P＜0.01）。早、中、晚期妊娠組bcl-2的表達(dá)強(qiáng)度與ki67的表達(dá)強(qiáng)度無相關(guān)性（P＞0.05），bax與ki67也無相關(guān)性（P＞0.05）。2 .2 妊高征與正常晚期妊娠胎盤組織中bcl-2、bax及ki67的基因表達(dá)bcl-2的陽性率在對照組與PIH兩組間差異無顯著性（P＞0.05），bax兩組差異無顯著性（P＞0.05），對照組ki67的陽性率明顯低于PIH組（P＜0.01）。bcl-2與ki67的表達(dá)強(qiáng)度無相關(guān)性（P＞0.05），bax與ki67也無相關(guān)性（P＞0.05）。2.3 妊高征胎盤組織中bcl-2、bax及ki67的基因表達(dá)bcl-2的陽性率在輕、中、重度PIH3組間差異無顯著性（P＞0.05），bax在3組間差異也無顯著性（P＞0.05），而ki67在輕度PIH組的陽性率明顯低于中、重度組（P＜0.01）。PIH輕、中、重度組妊娠bcl-2的表達(dá)強(qiáng)度與ki67的表達(dá)強(qiáng)度經(jīng)等級相關(guān)分析無相關(guān)性（P＞0.05），bax與ki67也無相關(guān)性（P＞0.05）。3 討論3.1 正常妊娠與妊高征胎盤組織bcl－2、bax的基因表達(dá)bcl－2是細(xì)胞凋亡的重要抑制基因。本研究中免疫組化已確定bcl－2定位在S－cell表達(dá)，并且從正常早孕到晚期妊娠持續(xù)出現(xiàn)[3，6]，因此保留滋養(yǎng)層細(xì)胞團(tuán)可能是維持妊娠的一種機(jī)制[1]。晚期妊娠bcl－ 2表達(dá)下降、可能是因?yàn)閎cl－2正常生理性功能，在孕晚期組成胎盤的細(xì)胞不再需要存活，可能是細(xì)胞凋亡的一種早期生物學(xué)變化，也可能與分娩有關(guān)[2]。 目前已知bcl－2和bax是bcl－2家族中重要成員。bcl－2表達(dá)水平較高時(shí)，可形成bcl－2和bax的異源二聚體，細(xì)胞凋亡受到抑制； bax表達(dá)水平較高時(shí)，可形成bax－bax同源二聚體，加速細(xì)胞凋亡。本研究中，對照組bcl－2與bax的陽性率為66．7％與80％，PIH組的陽性表達(dá)均為75％，表明大多數(shù)胎盤組織均呈bcl－2與bax高表達(dá)。bcl－2和bax表達(dá)已在一定水平上達(dá)到平衡，所以在胎盤組織中不起介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主導(dǎo)作用。 PIH組的bax并無隨病情的嚴(yán)重程度而有下降的趨勢，說明bax會進(jìn)一步影響妊娠的結(jié)局，反映病情的嚴(yán)重程度。這些結(jié)果可能提示，胎盤的細(xì)胞凋亡并不是bax單獨(dú)起作用，但有待進(jìn)一步證實(shí)。3．2 正常妊娠與妊高征胎盤組織中ki67的表達(dá)及bcl－2、bax的關(guān)系ki67同細(xì)胞增殖核抗原（PC－NA）、拓樸異構(gòu)酶Ⅱ一樣，在細(xì)胞群和組織中可作為增殖細(xì)胞的選擇性標(biāo)記。在細(xì)胞周期S、G2、M期均有表達(dá)，而G0期缺如。本研究中在C－cells中表達(dá)，妊娠早期表達(dá)最豐富，妊娠中期次之、晚期表達(dá)最少，提示早期胎盤活性是高增殖的[3]。在妊高征組中ki67表達(dá)多為強(qiáng)陽性，提示hi67的過度表達(dá)與C－cells活性有關(guān)。在PIH中，胎盤局部缺血是由于子宮胎盤血流下降引起[4]，因?yàn)镾－cells對缺血缺氧敏感，導(dǎo)致S－cells受損，所以出現(xiàn)代償性的過早成熟的C－cells增生。這種病理變化可能是S－cells損傷或壞死的指征，增生的C－cells修復(fù)和補(bǔ)償受損的S－cells，這種結(jié)果可能是絨毛對血流障礙的代償性反應(yīng)。Redline等[5]報(bào)道在先兆子癇胎盤中間層滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)PCNA時(shí)顯示陽性，但bcl－2為陰性。本組孕32周重度PIH胎死宮內(nèi)1例，其bcl－2表達(dá)為陰性，bax與ki67均為陽性，但病例少，需積累更多病例探討。 分析ki67與bcl-2及baX的關(guān)系，未發(fā)現(xiàn)它們之間有相關(guān)性，說明bcl－2和bax在胎盤發(fā)生過程中不引起細(xì)胞增殖，只是通過阻止細(xì)胞凋亡和延長細(xì)胞存活，增多細(xì)胞數(shù)量。ki67的表達(dá)增加說明C－cells增殖可能與其他基因的異常有關(guān)，如 p53、ras和myc等，是多種基因產(chǎn)生不同的途徑，在PIH中Ca2濃度的變化，TNF-α的變化等都可能直接或間接影響細(xì)胞凋亡。近年又報(bào)道，IL－10、Fas也參與細(xì)胞調(diào)亡[6，7]，因此，引起細(xì)胞凋亡并非一、兩種因子，而是多種因子共同作用的結(jié)果。
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